Transpolacental Passage of Insulin u kobiet w ciąży z cukrzycą insulinozależną – jej rola w makrosomii płodowej cd

Wysokowydajne profile do wymywania w chromatografii cieczowej. Panel A pokazuje profil standardów insuliny. Mieszanina bydlęcej (0,86 pmola), ludzkiej (1,38 pmola) i świńskiej (0,95 pmola) insuliny została wstrzyknięta na wysokosprawną kolumnę do chromatografii cieczowej. Eluat frakcje 0,3 ml zostały zebrane, a insulinę zmierzono za pomocą radioimmunooznaczenia poszczególnych frakcji. Panel B pokazuje profil ekstraktu z surowicy pępowinowej (0,4 ml) od niemowlęcia, którego matka była leczona tylko insuliną ludzką podczas ciąży. Wiązanie insuliny znakowanej 125I w tej próbce surowicy krwi wynosiło 13,7 procent. Wewnętrzny wzorzec (0,43 pmola Hum [SerB24]) dodano do porcji surowicy przed ekstrakcją w celu monitorowania odzyskiwania insuliny. Eluatowe frakcje (0,3 ml) zebrano i mierzono insulinę za pomocą testu radioimmunologicznego poszczególnych frakcji. Odzyskanie wzorca wewnętrznego wyniosło 0,21 pmol, a insuliny ludzkiej (Hum [ThrB30]) insuliny 2,26 pmol. Panel C przedstawia profil ekstraktu surowicy pępowinowej (0,5 ml) od niemowlęcia, którego matka była leczona insuliną bydlęcą i świńska w czasie ciąży. Wiązanie insuliny wyznakowane 125I w tej próbce kordsera wynosiło 29 procent. Wewnętrzny wzorzec (0,43 pmola) dodano do surowicy przed ekstrakcją w celu monitorowania odzyskiwania insuliny. Eluatowe frakcje (0,3 ml) zebrano i mierzono insulinę za pomocą testu radioimmunologicznego poszczególnych frakcji. Odzyskanie standardu wewnętrznego wyniosło 0,15 pmola, a bydła, natywnego człowieka (Hum [ThrB30]), a insuliny świńskiej odpowiednio 0,4, 0,71 i 0,24 pmola. Metoda Shoelsona i wsp. stosowano z niewielkimi modyfikacjami.11 Mieszaninę mieszaniny wzorców insuliny (9 pmol insuliny bydlęcej, świńskiej i ludzkiej) rozpuszczonych w 5 .l 0,1 M kwasu octowego zawierającego 0,5% albuminy surowicy bydlęcej wstrzyknięto na wysokosprawną kolumnę do chromatografii cieczowej , eluowano 30% (obj./obj.) acetonitrylu, a ich objętości elucji określono przez pomiar absorbancji przy 214 nm. Znajomość tego profilu wymywania umożliwiła wykrycie mniejszej masy każdej insuliny za pomocą testu radioimmunologicznego. Trzy insuliny (bydlęce, świńskie i ludzkie) można było wyraźnie oddzielić za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (ryc. 1A), a objętości elucji dla trzech analogów insuliny były stałe (w ciągu 0,5 minuty) w ciągu jednego dnia. Jednakże układ wysokosprawnej chromatografii cieczowej był bardzo czuły na małe zmiany stężenia acetonitrylu w fazie ruchomej (zmiana o 0,1% w stężeniu acetonitrylu zmieniała objętość elucji o 3-4 ml), co spowodowało, że dzień po dniu -dniowa zmiana objętości wymywania. Objętości wymywania ekstraktów surowicy analizowano zatem w porównaniu z wartościami wzorców insuliny poddanych wysokosprawnej chromatografii cieczowej tego samego dnia.
Suszone próżniowo próbki eluatów rekonstytuowano w 300 ul 0,1 M kwasu octowego zawierającego 0,5% albuminy surowicy bydlęcej po prostu wlewu do wysokosprawnej kolumny do chromatografii cieczowej. Frakcje 0,3 ml zebrano w probówkach zawierających 50 .l buforu boranowego (0,5 mol kwasu borowego na litr, zawierającego procent albuminy surowicy bydlęcej, pH 9,3), natychmiast zamrożono i liofilizowano.
[więcej w: komórki przepustowe, odczynnik millona, dermatofitoza ]