Infiltracja neointimy i rurkowo-śródmiąższowa przez mezenchymalne komórki biorcy w przewlekłym odrzuceniu alloprzeszczepu nerkowego ad

Wykorzystaliśmy połączone techniki immunohistochemiczne do identyfikacji komórek mezenchymalnych z hybrydyzacją .-aktynową mięśni gładkich i in situ w celu określenia, czy DNA chromosomu Y jest obecny w próbkach biopsji przeszczepów nerkowych. Metody
Pacjenci i biopsje
Nasza grupa rutynowo wykonuje biopsje allograftu nerkowego 1, 2, 3, 6 i 12 miesięcy po transplantacji; charakterystyka 76 pacjentów, którzy byli badani zgodnie z tym protokołem, została opisana wcześniej.12,13 Wszyscy pacjenci otrzymywali cyklosporynę, azatioprynę i prednizon do immunosupresji po transplantacji nerki i byli stabilni klinicznie w czasie biopsji. Protokół z biopsji został zatwierdzony przez komisję wydziałową ds. Wykorzystania ludzi w badaniach na Uniwersytecie w Manitobie, a wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział.
Zmiany w kanalikach, śródmiąższu, kłębuszkach i naczyniach zostały ocenione przez patologa, który nie był świadomy stanu klinicznego pacjentów. Patolog przydzielił półilościowe oceny tych zmian, stosując standardową klasyfikację Banffa14. Kryteria Banffa przyjęły ważność i powtarzalność i są szeroko stosowane w histologicznej analizie przeszczepów. Przeanalizowaliśmy naszą bazę danych dotyczących biopsji nerkowych i wybranych próbek z wszystkich niedopasowanych przeszczepów z oceną Banff CV2 (wskazującą na obecność przewlekłego odrzucenia z neointimą umiarkowanie naczyniowego) lub CV3 (wskazującą na obecność przewlekłego odrzucenia z ciężkimi zmianami naczyniowymi, w tym zwężenie światła naczynia o więcej niż 50 procent) i odpowiedniej tkanki dostępnej do badań. Zidentyfikowaliśmy takie próbki biopsyjne od sześciu mężczyzn, którzy otrzymali allograft od kobiety-dawcy i czterech kobiet, którzy otrzymali allograft od dawcy-mężczyzny.
Następnie wybraliśmy próbki biopsyjne od dwóch biorców allogenicznych od dawcy jako negatywne próbki kontrolne i biopsyjne od dwóch męskich biorców allograftu od dawcy-mężczyzny jako kontroli pozytywnej. Jako dodatkową kontrolę przebadaliśmy dziewięć nieprawidłowo dobranych próbek biopsji bez oznak odrzucenia (od pięciu mężczyzn biorących udział w allograftach od kobiety-dawcy i czterech kobiet biorących udział w allograftach od dawcy-mężczyzny). W żadnym przypadku nie badaliśmy próbek biopsyjnych pobranych od jednego pacjenta więcej niż raz.
Połączona analiza immunohistochemiczna i hybrydyzacja in situ
Wszystkie procedury immunohistochemiczne przeprowadziliśmy przy użyciu aparatu Microprobe (Fisher Scientific) z półautomatycznym wybarwianiem kapilarnym, aby zapewnić spójność i powtarzalność wyników barwienia. Bloki utrwalone formalnie, zatopione w parafinie pocięto na sekcje o grubości 4 .m, a wycinki umieszczono na szkiełkach mikroskopowych (ProbeOn Plus, Fisher Scientific) i inkubowano. Analizę immunohistochemiczną z zastosowaniem przeciwciała przeciw .-aktynie mięśni gładkich (M0851, Dako) jako markera dla komórek mięśni gładkich 15 przeprowadzono zasadniczo jak opisano wcześniej.16 Hybrydyzację DNA in situ dla ludzkiego chromosomu Y wykonano natychmiast przy użyciu pHY2,1, marker powtórzenia chromosomu Y znakowany digoksygeniną (1558196, Boehringer Mannheim)
[hasła pokrewne: lepkość krwi, komórki gruczołowe, limfoscyntygrafia kończyn dolnych ]
[hasła pokrewne: ból w górnej części klatki piersiowej, wiązki kolateralne, komórki gruczołowe ]